Mykorrhiza Sporen Aussieben

Hi,

ich schreibe meine Bachelor Arbeit über Mykorrhiza und derein Einfluss auf das Wachstum von Äpfel in Vitro. Meine Betreuer haben allerdings von der sterilen Kultur von Mykorrhizen noch keine praktische Erfahrung, weswegen ich bei einem Arbeitsschritt ein paar Probleme hab. (Bevor Fragen aufkommen: Ich habe mir das Thema selbst ausgesucht)
Und da ich gesehen habe, dass dieses Forum recht wissenschaftlich geführt wird, hoffe ich einfach, dass mir hier jemand weiterhelfen kann.

Es geht um das Nasssieben, bzw Aussieben von Sporen aus einem Boden.
Bisher habe ich immer eine Bodenprobe, so 3-5 Teelöffel, mit Wasser vermischt und über einem 250 µm und einem 50 µm Sieb dann ausgesiebt, indem ich Wasser drüberlaufen lies. Danach hab ich den Inhalt des 50 µm Siebs in eine Petrischale gegossen, und im Mikroskop untersucht. Dabei konnte ich jedoch nur sehr wenige Sporen finden, fast schon zufällig nur.
---> Beim nächsten mal werde ich die Bodenprobe vorher noch 10min durchrühren
Ich habe mich auch beim Zentrifugieren mit einer Zuckerlösung probiert, doch das Ergebniss ist im Endeffekt das gleiche.

Ich habe einfach gehofft, dass mir von euch jemand weiterhelfen kann, praktische Tipps geben kann oder sogar eine kleine Anleitung schreiben kann. Natürlich gibt es genügend Veröffentlichungen, welche das "wet sieving" beschreiben, aber irgendwie scheint es bei mir dann doch nicht zu klappen.

Hi,
danke erstmal für die vielen Antworten. Ich konnte leider nicht früher antworten:

Die Mykorrhiza Pilze sind allgemein Pilze die eine Verbindung mit Pflanzenwurzeln eingehen. Manche Pilze davon bilden Fruchtkörper (Trüffel, Pfifferling,....), doch die meisten bilden keine Fruchtkörper. Von sehr vielen ist ja noch nichtmal eine sexuelle Fortpflanzung bekannt, sondern nur eine asexuelle.

Mykorrhiza Pilze sind für den Agrar- und Gartenbaubereich deswegen interessant, weil die Symbiose aus Pilz und Pflanze viele pflanzenbauliche Vorteile mit sich bringt, wie zum Beispiel ein besserer Ertrag oder gewisse Krankheitsresistenzen. Leider bringt es herzlich wenig ausgewachsene Apfelbäume mit einem bestimmten mykorrhizierenden Pilz zu infizieren, da diese Sporen überall zu finden sind und sich ganz von alleine Mykorrhizen bilden. Man kann davon ausgehen, dass 80% aller Landpflanzen in Symbiose mit "Wurzelpilzen" leben.

Wenn ich nun einen Vergleich zwischen nicht-mykorrhizierten und mykorrhizierten Pflanzen machen will, dann brauch ich ein steriles System, damit mir nicht irgendwelche Sporen aus Versehen in meine Erde landen, und ich somit _nur_ mykorrhizierte Pflanzen haben. Das Mittel der Wahl ist deswegen die Gewebekultur, in der die Pflanzen einzeln und steril in Reagenzgläsern wachsen. Sie haben dafür ein spezielles Nährmedium, welches vorher sterilisiert wurde, und somit kann man den Vergleich mykorrhiziert und nicht-mykorrhiziert machen.

Nun muss ich aber die eine Hälfte der Reagenzgläser irgendwie infizieren, damit dort der Pilz, zusammen mit meinem kleinen Apfelbäumchen wächst. Und dafür brauche ich eben Sporen. Ich kann kein Mycel aus dem Boden nehmen, und dieses z.B. durch NaClO sterilisieren, da es schneller kaputt gehen würde als die Bakterien die sich daran befinden. Die Sporen sind aber robuster, und deswegen kann ich die Sporen aus dem Boden aussieben, sterilisieren, vereinzeln, und in Reagenzgläser geben.

So zumindest die Theorie. Die Praxis zeigt mir, dass gerade das Siebverfahren, obwohl es so simpel erscheint, ein paar Tücken hat.
Eine Tücke meine ich gefunden zu haben: Und zwar habe ich die Erde, in der sich die Sporen befinden, nicht lange genug eingeweicht. Anscheinend lösen sich die Sporen besser von der Bodenmatrix, wenn sie 30 Minuten in Wasser eingeweicht wurden, eventuell sogar unter ständigem Rühren. Das werde ich morgen erstmal ausprobieren.
Ansonsten lautet mein Plan B, dass ich kleine Wurzelstücke entnehme, und probiere, diese zu sterilisieren. Mykorrhizieren Pilze (zumindest manche davon) wachsen in die Wurzel hinein und bilden dort arbuskuläre Strukturen mit sogenannten Vesikeln. Das kann als Infektionsquelle genutzt werden.
Und natürlich Standardplan C: Die Sporen einfach kaufen (ich befürchte, dass es aus Zeitmangel darauf hinauslaufen wird, aber so schnell gebe ich nicht auf)

Mir ist schon aufgefallen, dass meine Fragestellung vom eigentlichen Thema dieses Forums abweicht, doch ich wollte einfach soviel Ratschläge wie möglich einholen.

Bis die Tage, ich halte euch auf dem Laufenden.

Vielen Dank für deine Bemühungen, diese Veröffentlichung herauszusuchen. Ich werde gleich mal danach suchen, auch wenn sie mittlerweile hinfällig geworden ist.

Ich war heute zum ersten mal nach Weihnachten wieder im Labor, und denke, ich hab nun anständige Resultate beim aussieben.

Bisher habe ich immer 30 Minuten lang die Erde mit Wasser getränkt, nun hab ich zusätzlich noch einen Rührfisch dazugetan, und das Ganze eben 30 Minuten lang durchgerührt. Also hab ich wie gewohnt ausgesiebt, mit einer finalen Siebgröße von 48 µm. Dies hab ich dann zentrifugiert (1x für 4 Minuten bei 4000rpm und danach nochmal mit Zuckergradienten), und siehe da: Beim Blick durch das Mikroskop sehe ich viele viele viele Sporen.

Ich kann es einfach nicht fassen, dass es am umrühren der Erde/des Substrat lag.

Die Veröffentlichung werde ich natürlich trotzdem noch durchlesen, deine Arbeit soll ja nicht umsonst gewesen sein.

Vielen Dank.

Naja, also erst einmal gehe ich davon aus, dass die Glomus Arten weder zu Basidiomycota noch zu Ascomycota gehören, sondern zu den Glomeromycota.
Weiterhin hoffe ich auf eine hohe Reinheit während der Herstellung der Pilzsporen/des Substrats.
Und dann ging ich stark davon aus, dass nur Pilze der Familie Glomeromycota mykorrhizieren können.
Natürlich will ich keine anderen Sporen in meine in Vitro Äpfel bekommen, doch dafür sterilisier ich die Sporen ja, und hoffe, dass die Mykorrhiza Sporen mehr aushalten als Andere.

Also wenn man dem Hersteller vertrauen darf, dann hat er mir homogenes Substrat geschickt, welches von ihm autoklaviert, und dann mit den Pilzsporen beimpft wird. Dazu kommt noch eine Wirtspflanze um das Wachstum der Mykorrhiza Pilze zu fördern. Rein theoretisch sollten nur Sporen einer Art vorkommen.
In der Praxis kommen aber immer wieder Verunreinigungen vor, weswegen man sich darauf vielleicht nicht zu 100% verlassen sollte.
Die Wissenschaftlichste Methode wäre es daher, anhand der Morphologie der Sporen sicherzustellen, dass sie zu der gewünschten Art gehören, und diese dann zu vereinzeln, z.B. durch einen nassen, feinen Pinsel oder einer ganz feiden Nadel oder Pinzette. Solch eine einzelne Spore kann man dann in Vitro auf Karotten oder Tomatenwurzel geben, und diese dort vermehren lassen. So hat man nach ca. 12 Wochen reichlich Sporen, von denen man sicher sein kann, dass sie nur zu einer Art gehören.
Aus Zeitgründen werd ich das aber wohl leider nicht mehr schaffen. Also entwede rkauf ich mir vom Spezialisten Pilzsporen, die er mit genau dieser Methode produziert hat, oder ich verwende einfach die ausgesiebten Sporen, mit der Annahme, dass der Großteil der Sporen meiner gewünschten Art entspricht.

Falls die Frage darauf abzielte, wie ich die Sporen vereinzelt in die in Vitro Bäumchen dazugeben kann: Ich hab bisher die Sporen sterilisiert und mit autoklaviertem Wasser aufgefüllt, damit ich quasi eine Sporensuspension habe. Dann schwenke ich das Glas immer, und geb 1-2 Tropfen zu einem Baum dazu.