Handsequenzierer: Jetzt schon Realität? - Update zu GBOL

Hi Stefan und Wolfgang,

alles relevante Punkte, keine Frage.

Meine Absicht war eigentlich vorrangig auf die mittlerweile realistischen Möglichkeiten aufmerksam zu machen, die uns die Weiterentwicklung der Technik gebracht hat.

Es gibt natürlich diverse Eventualitäten, die Klärungsbedarf hätten, wenn man sich zur Anschaffung des Equipments entschließt und es ist sinnvoll sich da vorher Gedanken drüber zu machen.

Dafür braucht's aber denke ich einen Rahmen und eine Zielsetzung.

Mal ein paar Beispiele für potentielle Anwendungsfälle auf die man hinarbeiten könnte.

1. Flächenkartierungen genetisch absichern (ggf. nur cf. und unklare Bestimmungen um Kosten zu sparen)

2. "Mycoblitz". Könnte man auch abwandeln, dass man z.B. auf Fachtagungen auf denen ohnehin bereits gründlich gefachsimpelt, bestimmt und mikroskopiert wird hinterher nochmal Sequenzen machen lässt. Dann hätte man auch Frischmaterial mikroskopiert an dem vielleicht auch der ein oder andere Experte dran saß. Ich denke das wäre als erster Testlauf nach Anschaffung des Equipments eine sinnvolle Version. Wenn dabei genetisch "neue" Arten herauskommen, könnte man ja auch gleich (neo)typisieren. Wenn sich kein Experte in der DGfM findet, kann man das Material auch anderen Forschern anbieten.

3. Für DGfM Mitglieder jährliche Kontingente an Sequenzen anbieten (Selbstkostenpreis oder eben gegen Spende um Schulungen/Equipment/Lagerung zu refinanzieren)

Es gibt sicher noch weitere Optionen, wenn man da mal gemeinsam brainstormt.

Man muss natürlich so einiges vorher abklären, das ist klar. Klärungsbedürftige Fragen, die mir so spontan einfallen oder die im Thread schon aufkamen:

1. Wo stellen wir das Labor auf? (Räumlichkeiten, "Laboranten" im Umkreis verfügbar?)

2. Wen können wir schulen um die Sequenzierung durchzuführen? (Mitglieder nach Interesse/Zeit befragen, Kooperationen mit Unis/anderen (Pilz)vereinen mit Erfahrungswerten etc.)

3. Wo können die Exsikkate gelagert werden? Da kommt ggf. ja so einiges zusammen.

4. Wo speichern wir die entsprechenden Fotos/Beschreibungen der Funde, damit sie von anderen Forschern verglichen werden können? (Persönliche Anmerkung: Ich finde iNaturalist ideal, "Pilzgucker" ist für mich wahnsinnig unintuitiv)

5. Finanzierung. Da habe ich zu wenig Einblick was die Finanzen der DGfM angeht. Die Anschaffungskosten sind noch relativ einfach zu eruieren. Bei den laufenden Kosten gibt's natürlich noch Klärungsbedarfe.

Das sind alles keine Dinge, die man mal so nebenbei klärt, aber es ist denke ich auch nicht utopisch, dass man so etwas auf die Beine gestellt bekommt.

Der Verein "Hoosier Mushroom Society" wurde erst 2009 gegründet und sie haben in der kurzen Zeit für sich einen Modus gefunden, in dem sie die moderne Technik gewinnbringend zur Erforschung von Pilzen einsetzen. Warum sollte die DGfM das nicht können?

LG,

Schupfi

Hallo zusammen,

Selbst mit einer Sequenz kann man nicht viel mit anfangen, wenn Vergleichsdaten fehlen und man sich mit Sequenzen nicht auskennt.

Die Vorarbeit Pilze suchen, Fotos vom Fund machen, Mikro/Makrobilder, die dazugehörigen Sporenmessungen und anfertigen von Belegen gehören dazu, damit man überhaupt einen Überblick über den Pilz bekommt.

Sonst bringt einem die Sequenz und der Fund nichts, auch da die Sequenz keine Bestimmung ersetzt, wenn die Sequenzen in der Datenbank nicht nachvollziehbar, nicht vorhanden sind oder bei Experten unter Verschluss sind.

Ich frage mich, ob das nicht Sinn macht, etwas aufzubauen, wo Institute, Unis, Mykologen, Hobbymykolgen ect.... ihre Interessen an Pilze (Familie, Gattung, Art...) angeben können, woran sie forschen und dementsprechend auch genetisch bearbeiten.

Vielleicht in etwa so ?

Das ganze sollte halb-öffentlich sein, also so dass Vermittler an die jeweilige Kontaktperson den Fund weiterleiten und wissen welche Voraussetzungen die jeweiligen Interessenten an einem Fund haben.

Es hört sich komisch an, aber es hilft, dass die Fachleute nicht vollgespammt werden oder den halben Tag damit beschäftigt sind Personen zu erklären, warum ihr Fund nicht entgegengenommen wird und welche Anforderungen sie an einem Fund haben.

Jeder Pilz ist anders und auch die Anforderungen, sowie Bearbeitung ist im Labor unterschiedlich, so dass manche Pilze nicht älter als 1-2 Wochen sein dürfen, andere nicht älter als 3-5 Monate und bei letzterem ist das Alter egal.

Dann gibt es welche die direkt sequenziert werden können, andere benötigen eine Kultur und so weiter.

Auch spielt es eine wichtige Rolle, dass Fundortangaben gemacht werden und die Vorarbeit.

Selbst, wenn der Finder die Vorarbeit nicht machen kann, eventuell findet sich jemand der dies tut (ist oft der Fall wenn es ein besonderer Fund ist) und den Fund später weiterleitet.

Das wäre eine grobe Idee, ist aber auch mit viel Arbeit verbunden und deckt nicht alle Pilze ab, aber man hätte eine Übersicht und kann das Nutzen was da ist.

Viele Projekte könnten so zukünftig realisierbar sein oder bereits angefangene Projekte könnten besser voran kommen.

Das soll jetzt nicht, das Thema Sequenzieren schmälern, aber vielleicht ein Mittelweg sein, um sich die Teuren kosten der Technik zur Sequenzierung und Schulung des Personals zu sparen.

So hätte man auch mehr Zeit für das Pilze suchen

VG : Thorben

Hi.

Meiner Meinung nach wird andersrum eher ein Schuh draus. Die Aussage in dem Video vorne war relativ klar: Nicht die Kosten werden der limitierende Faktor bei der Forschung sein, sondern der Mangel an Material!

Nicht wir sollten die Experten anschreiben, sondern die Experten sollten uns anschreiben, wenn sie an einer Artengruppe arbeiten und wir bereits die Feld-Doku, Fotos, Exsikkate, Mikroskopie und ggf. sogar Sequenz rumliegen haben. Der Experte sollte einfach alle erhobenen Infos einsehen können und kann dann selbst entscheiden ob er das Material haben will oder nicht. Normalsterbliche kriegen doch gar nicht mit, wer gerade an welcher Gruppe arbeitet. Ich habe mittlerweile auch ein kleines Herbar, die Pilze liegen in einer Schublade, meine Daten dazu auf meiner Festplatte. Da nützen sie eigentlich niemandem etwas, außer mir. Und ich gucke nicht regelmäßig ob sich weltweit in irgendeinem Land gerade eine Arbeitsgruppe bildet, für die ein Teil meiner Sammlung vielleicht interessant wäre. Und wir, die Hobby-Pilzler, sind die Leute, die sowieso in ihrer Freizeit schon ständig auf Wald und Wiese unterwegs sind, einfach aus Spaß an der Freude, während die Berufs-Mykologen ziemliche Anstrengungen und Kosten aufwenden müssten um die passenden Untersuchungsobjekte selbst zu sammeln.

Die Lösung der Amerikaner ist da pragmatisch. Die hängen an ihre Sequenzen die iNaturalist-Fund-ID mit dran und laden dort die entsprechenden Infos hoch. Wenn nun jemand anderes einen Fund sequenziert und einen Treffer hat, kann er da direkt die Beobachtung anschauen, vergleichen und das Material nachfordern, wenn es seinen Anforderungen genügt.

Das Alter spielt nur bedingt eine Rolle, im Video wird gesagt, dass 20-30 Jahre alte Funde zum größten Teil keine Probleme bei der Sequenzierung machen. Die Bearbeitung ist auch nicht unterschiedlich, sondern ganz im Gegenteil, bei diesem Verfahren standardisiert.

Klar gibt's da wieder Feinheiten, dass sich manche Artengruppen nicht mit den Standard-Loci oder nur über eine Multi-Gen-Analyse korrekt zuordnen lassen (z.B. Leccinum, Helvella), da könnte man zum Beispiel vorher mal eine Liste machen mit Gattungen/Artengruppen bei denen die ITS zur Artbestimmung nicht geeignet ist, die nimmt man dann halt nicht in die ITS-Sequenzierung. Wer andere Loci noch auswerten will, weil er zum Beispiel für eine Publikation noch ein Phylogenie-Bäumchen basteln will, wofür die ITS eher nicht geeignet ist, der kann sich das Material dann auch einfach nachbestellen.

In dem Zusammenspiel wäre das allerdings auch wieder eine andere Zielbestimmung:

4. Aufbau einer zentralen Herbariums-Datenbank, bei der Forschende Material einsehen und anfordern können.

Dafür bräuchte man aber noch nicht mal zwangsläufig eigene Sequenzen, auch wenn's natürlich praktisch wäre, diese mit einzubinden, sofern vorhanden.

Auf die Dauer würden dadurch auch Sequenzen ohne Referenzen abnehmen. Die Vergleichsdaten muss ja schließlich auch erstmal jemand schaffen - warum nicht auch die Mitglieder der DGfM selbst? Es gibt da doch viele fähige Leute. Wenn die "hauseigenen" DGfM-Mykologen einen Fund nicht (neo)typisieren wollen/können, kann man ihn ja immer noch bereitstellen für andere, die Interesse daran haben. Und ordentlich dokumentieren müssen wir ja auch mit der Technik der Sequenzierung weiterhin. Das schafft ja überhaupt erst die Grundlage dafür, dass ein Fund wissenschaftlich "verwertbar" wird. Die Zeit fürs Pilze sammeln nimmt nicht ab. Der Organisationsgrad, die Vernetzung von Citizen-Science und Wissenschaftlern und die Arbeitsteilung nimmt stattdessen zu.

LG,

Schupfi

Hallo Schupfi, hallo Thorben,

Danke für die Anregungen.

Was Neubeschreibungen und Typisierungen angeht: da sind die Kompetenzen in DE auch auf zwei Handvoll Leute beschränkt, was Großpilze anbelangt. Lassen wir das mal außen vor, und gehen auch davon aus, dass nur mikroskopierte Proben akzeptiert werden.

Wenn man sich zum Ziel setzt, pro Jahr 2 FlowCell-Platten zu füllen (also 2000 Funde), sind das 2 T€.

Dann braucht man die Chemikalien für PCR: 5 T€.

Die Arbeitszeit für die PCR: an einem Tag schafft man vielleicht 40 Proben. Für 2000 Proben also 50 Arbeitstage - das ist ehrenamtlich nicht mehr zu stemmen, sondern entspricht 1/4 Stelle, 15 T€.

Damit hat man die Computer-Arbeitszeiten noch nicht abgedeckt. Der Finder will vielleicht eine E-Mail mit dem Ergebnis etc.

Also rund 25 T€/Jahr an laufenden Kosten. Das könnte die DGfM mit dem heutigen Budget nicht mehr aufbringen.

Grüße,

Wolfgang

Hi Wolfgang,

ich glaube der Preis, den du für die Chemikalien für die PCR ansetzt ist deutlich zu hoch, müsste ich aber im Detail nochmal genau prüfen. Wie hast du den berechnet?

Die Notwendigkeit und Dauer der PCR ist natürlich ein limitierender Faktor, der sich mit teurerem Equipment mitigieren lässt, sofern Zeit der limitierende Faktor ist. Wenn der Thermocycler nur eine Handvoll Proben auf einmal schafft ist das so, im Protokoll von Stephen Russel macht er 96 Proben auf einmal. Deutlich mehr Samples in einem Rutsch sind auch möglich, aber klar, dann wird's in der Anschaffung schon arg teuer. Alternativ wäre zu prüfen, wie weit man die Anzahl der Durchläufe reduzieren kann. Wenn ich das richtig verstanden habe führen zu viele Durchläufe beim Next-Generation-Sequencing (NGS) auch eher zu Fehlern. Irgendwo hatte ich die Tage mal gelesen, dass man das deutlich reduzieren kann und trotzdem gute Ergebnisse erhält. Finde ich nur leider nicht mehr wo das stand.

Gelelektrophorese kann man weglassen, da die ein oder andere fehlgeschlagene Amplifizierung den Braten beim NGS nicht mehr fett macht.

Sollte sich das alles als zu komplexes Projekt für die Eigenanschaffung und Durchführung durch die DGfM darstellen (kann ich nachvollziehen, ist ja ein Riesenprojekt und auch in den USA lief das erst durch Fördergelder an) könnte man sich alternativ aber vielleicht mitnehmen, dass es mittlerweile effizientere Methoden gibt um relativ viele Barcodes in einem Rutsch zu erhalten als die +-20€ pro Sequenz beim klassischen Sanger-Sequencing.

Ich nehmen an, dass auch Labore entsprechende "High-Throughput"-Verfahren mehr und mehr anbieten. Dann kommt man natürlich nicht mehr auf den sehr günstigen Selbstkostenpreis, den man in Eigenregie erhalten könnte, aber ich denke die Kosten pro Sequenz ließen sich trotzdem um einiges drücken. Die Hoosier-Mushoom Societey bietet zum Beispiel folgendes aktuell noch an (ist allerdings vorrangig für Nordamerika):

So extrem günstig wird's denke ich bei uns noch nicht sein, aber die Kosten werden auf lange Sicht sicherlich weiter fallen.

Gefühlt ist es ja aktuell so, dass viele Pilzler relativ unkoordiniert als Einzelkämpfer/Arbeitsgruppe ihre spannenden Funde nach Spanien schicken zur Sanger-Sequenzierung. Vielleicht könnte man da dann ja koordiniert poolen und ein Kontingent festlegen, das die DGfM fördert. Man könnte auch am Jahresanfang festlegen worauf im aktuellen Jahr der Fokus liegen soll und die Mitglieder ermutigen Arten aus der Gattung/Gruppe gezielt zu sammeln und (im Idealfall standardisiert und wissenschaftlich verwertbar) zu dokumentieren.

Also beispielsweise: 2024 unter dem Motto "Barcoding Melanoleuca".

Was sich halt gerade weltweit ändert, ist der Prozess zur Biodiversitätserfassung. Das geht mittlerweile in Richtung "Barcode first - identification second". Das ganze Fass mit der Zuverlässigkeit der Bestimmung auf Artebene über Barcodes und die Diskussion um die Definition von Artkonzepten würde ich jetzt hier mal ausklammern, wobei das natürlich bei der Ausrufung eines Mottos vorher zu prüfen wäre, ob die gewählte Gattung/Artengruppe sich erfahrungsgemäß über die erfassten Loci einigermaßen trennen lassen (also nicht gerade mit Helvella oder Cantharellus loslegen). Die Artabgrenzungs-Streitereien kann man im Zweifel ja den Forschern überlassen, die dann typisieren oder eben synonymisieren.

Würde man diesen Weg eruieren, wäre der oben genannte Punkt 4 als Zielsetzung meiner Meinung nach auch weiterhin sehr lohnenswert, also der:

4. Aufbau einer zentralen Herbariums-Datenbank, bei der Forschende Material einsehen und anfordern können.

Das ginge über ein iNaturalist-Projekt beispielsweise, dafür müsste man nicht mal etwas neu entwickeln.

LG,

Schupfi

Hallo Schupfi,

den Chemikalienpreis für Extraktion und PCR hatte ich von einer beliebigen Webseite - kann gut sein dass da 'was zu sparen ist.

Der Hauptfaktor ist aber immer noch die Arbeitszeit. Das sieht man auch bei den Preisen von Hoozier, die ja von 9$ auf 1.75$ sinken, wenn man statt kleiner Menge Einzel-Exsikkate viele "tissue in tube", also Lamellenstück in einem Eppendorf-Gefäß einliefert. Wie man den ganzen Rest des Prozesses für 1,75 schafft, ist mir noch ein Rätsel - da hätte ich als DGfM Schatzmeister noch kein Problem das 2000fach zu sponsern...

Die reine Sanger-Sequenz kostet in Spanien übrigens 6 €, der Rest der 20+ € ist Vorbereitung.

Für die digitale Funderfassung von Pilzen baut das Rote-Liste-Zentrum gerade eine Webseite auf Basis von Indicia, die für den Zweck geeignet wäre.

Staatliche Fördermittel ist dagegen gerade schwierig. Mit der FDP-Ministerin geht ohne Industriepartnerschaft nix mehr.

In welchem öffentlichen Herbar die Exsikkate am Ende hinterlegt sind, ist schon fast wieder egal, solange es am Fundpunkt angegeben ist.

Grüße,

Wolfgang

Hallo Oliver,

die DGfM ist sicher kein winziger Verein, aber so richtig groß ist sie mit 1.500 Mitgliedern nun wirklich nicht. Vor allem aber ist die DGfM ein völlig dezentral organisierter Verein, wo selbst die Mitgliederverwaltung in der privaten "Küche" stattfindet. Es wäre also schon ein erheblicher organisatorischer Aufwand für so ein Projekt notwendig. Da müsste man kalkulieren und nach Lösungsmöglichkeiten und Kooperationen suchen. Zur Zeit sieht die Politik solche Dinge nicht als förderungswürdig an. Wir sind mit unseren Anträgen zu Sequenzierung-Projekten erst einmal gescheitert.

Beste Grüße

Stefan F.

Hallo Oliver,

die DGfM hat aber den Vorteil, dass durch viele Mitglieder ein erhebliches theoretisches und praktisches Know How zum Thema vorhanden wäre.

Beste Grüße

Stefan F.

Hi Oliver,

Da bin ich gespannt, was Du von GBOL berichtest.

Die 2, 3 Projekte, von denen ich weiß, mussten selbst noch Geld mitbringen, damit es für die Sequenzierung reicht. Ja, auf der Webseite liest es sich anders.

Deinen Traum teile ich, aber die konkrete Hoffnung, dass verantwortliche staatliche Stellen sich dafür interessieren, nicht.

Gruß,

Wolfgang

Hallo Oliver,

glaub' nicht alles was GBOL Dir erzählt hat - die Realität sah anders aus.

Frag mal die, die dort Pilze sequenziert haben wie Markus Scholler oder Ursula Eberhard. Oder noch besser die, die letztlich darauf verzichtet haben wie Bernd Oertel.

Grüße,

Wolfgang