Handsequenzierer: Jetzt schon Realität? - Update zu GBOL

Hallo Oliver,

für andere Organismengruppen gibt es transportable Sequenzierer schon länger. Die Tiefe der notwendigen Abfrage ist ausschlaggebend für einen Erfolg.

Beste Grüße

Stefan F.

Zitat von Bibliothekar

Die Tiefe der notwendigen Abfrage

Was genau meinst du damit?

Hallo,

hier 3 Beispiele für 2 verschiedene Geräte - Nanopur und Minion

Mini DNA sequencer tests true | EMBL

The MinION miniature DNA sequencer has been evaluated by an open, international consortium and the results published in F1000Research.

www.embl.org

Real-time DNA barcoding in a remote rainforest using nanopore sequencing

Advancements in portable scientific instruments provide promising avenues to expedite field work in order to understand the diverse array of organisms that…

www.biorxiv.org

Portable Sequencing Is Reshaping Genetics Research

Portable sequencing is making it possible for biologists to perform DNA analysis anywhere in the world. How is this technology reshaping the way they work?

www.labiotech.eu

Mit Tiefe ist gemeint, dass die Abfragen nicht zu komplex sein dürfen, wie das oft für Pilze eben notwendig ist. Es werden wohl weniger Basenpaare verglichen oder andere Abschnitte der DNA benutzt.

Beste Grüße

Stefan F.

Hallo Oliver,

es ging mir nicht um neue Firmen, sondern ich wollte zeigen, dass das schon länger läuft. Der oberste Link ist eine Meldung von 2015.

Beste Grüße

Stefan F.

Hier wurde das 2019 auch schon mal thematisiert und auch die Frage aufgeworfen, ob nicht die großen Pilzvereine so etwas anschaffen könnten:

Thema

Vor-Ort-Sequenzierung im Gelände - nichts ist mehr unmöglich

Servus beinand,

man könnte meinen, es wäre der erste April, wenn ich schreibe, dass es mittlerweile einen Minisequenzierer gibt, mit dem man direkt vor Ort sequenzieren kann. Ganz so einfach, wie man es sich denkt, ist es zwar nicht (man braucht die richtigen Primer und man muss ein bisserl pipettieren - der Tricorder von Star Trek wurde noch nicht erschaffen), aber es geht offenbar.

Dieses paper zeigt, dass man im Regenwald direkt vor Ort Reptilien über Sequenzierung bestimmen kann:
Aaron…

Tricholomopsis

18. Mai 2019

Bibliothekar: du hast doch recht viel Einblick in die DGfM, oder verwechsle ich dich da? Oder sonst kann sich vielleicht auch Wolfgang P. hier einklinken? Wolfgang, hatten wir das Thema nicht am Rande eines Saftlingstreffen ganz flüchtig gestreift?

Wisst ihr, ob das mal diskutiert wurde und falls ja, woran es hakt? Ich hätte eher vermutet, dass es wegen der Betriebskosten (insbes. Personal) schwierig ist.

Welche Genabschnitte man sich anschaut, liegt nach meinem Verständnis ja nur an den verwendeten Primern. Ich kann mir nicht vorstellen, dass die Geräte in dem Punkt technisch limitiert sind, oder liege ich da falsch?

P.S.: Ich hoffe, dieses Thema wird nicht schon wieder mit DGfM-Bashing zugemüllt wie fast jedes, in dem der Verein erwähnt wird.

Hallo Craterelle,

Du verwechselst mich nicht. Das Hauptproblem bei der Sequenzierung ist gar nicht so sehr die Datengewinnung, sondern die Aufbereitung und Auswertung der Daten. Dies erfordert Fachpersonal und kann nicht im Ehrenamt abgedeckt werden.

Ob die mobilen Geräte für Pilze geeignet wären, kann ich momentan nicht beurteilen. Ich muss mich erst wieder frisch einlesen. Pilze sind ja schon im universitären Labor mitunter nicht ganz unproblematisch in der Sequenzierung, da sie vielen äußeren Einflüssen ausgesetzt sind. Es bleiben also vorerst noch viele offene Fragen.

Beste Grüße

Stefan F.

Hallo an alle,

ich hatte vor ein paar Jahren einen Nanopore-Sequenzer in der Hand, als ich bei Prof. Thines zu Besuch war.

Damals hatte er glaube ich ein Projekt, damit im Feld landwirtschaftliche Proben auf Rostpilze zu screenen.

Die Nanopore-Technologie arbeitet anders als klassische Amplifizierung bestimmter Genregionen. Vielmehr werden längere DNA Abschnitte durch eine Pore gesaugt und im Vorbeifließen abgelesen.

Das erzeugt ganz andere Daten - davon aber genug um ein sehr starkes Labtop auszulasten. Weil das statistische Rauschen die Signale überlagert, muss man jede Probe min. 10x messen.

Damals waren die Einweg-Probenhalter sehr teuer und die Auflösung zu schlecht, um eng verwandte Arten zu trennen. Wie es aktuell aussieht, weiß ich leider nicht.

Grüße,

Wolfgang

Zitat von Oliver

aber eine PCR wird man Zuhause ohne Labor auch hinbekommen.

Hi Oliver,

Schon die dafür erforderlichen Chemikalien wirst Du aufgrund der Gefahrstoffverordnung nicht bekommen (gut so! Die gehören auch nicht in einen Kühlschrank, in dem auch Lebensmittel sind, und die Abfälle nicht ins Klo).

Ergibt auch keinen Sinn, denn wenn Du nur einzelne Loci sequenzieren willst, ist Nanopore die falsche Technologie. Und einen chromatographisch arbeitenden Sequenzer wird sich keiner in den Keller stellen.

Was ist denn das Problem daran, eine Labordienstleistung in Anspruch zu nehmen? Früher hat man auch seine Diafilme zum Entwickeln gebracht.

Von der Auswertung der Rohdaten haben wir noch gar nicht gesprochen.

Gruß,

Wolfgang

Hi Oliver,

Zitat von Oliver

Sind das nicht überwiegend mehr oder minder ungefährliche Substanzen

na, zu Beginn der PCR wird die DNA extrahiert und ausgefällt. Das tun die Substanzen natürlich auch mit der DNA Deiner Zellen, wenn Du es Dir über die Hand schüttest. Also zellgiftig.

Am Ende der PCR wird das Wachsum der DNA-Kette mit Fluoreszenzfarbstoffen unterbrochen. Das passiert auch bei einer Zellteilung in Deinen Zellen. Also zellgiftig, mutagen und potenziell krebserregend.

Die freien Basen sind dagegen harmlos, und die Pilz-Primer werden an Deiner DNA wohl auch nicht andocken können

Zitat von Oliver

Ich finde die Gerät von Nanopore trotzdem sehr faszinierend.

ich auch! In einer halben Stunde ein Virus-Genom komplett sequenzieren mit einer größeren Streichholzschachtel...und das ohne Probenvorbereitung. Mir fehlt nur leider der Anwendungsfall dazu.

Gruß,

Wolfgang

Hi.

Hier ein ausführlicher Beitrag, der den Prozess mit dem "Taschensequenzierer" bei Pilzen näher erläutert und auch einige der Miskonzeptionen hier im Thread entkräftet:

Ist allerdings auf Englisch.

tl,dw:

Ja, man kann damit Pilze barcoden und zwar auch die für uns Pilzler hauptsächlich relevanten Barcodes. Die vorherige DNA-Amplifikation ist aber aus Kostengründen immer noch notwendig/empfehlenswert zumal wir ja meistens sowieso konkrete Abschnitte der DNA haben wollen.

Der Prozess ist mittlerweile sehr viel weiter ausgereift und zuverlässiger.

Größter Vorteil sind die sehr geringen Kosten um einen Barcode zu erhalten, wenn man entsprechend skaliert und die Flow Cells auslastet (0,60$ pro Barcode vs. 10$+ pro Barcode mit Sanger Sequencing). Die Anschaffungskosten für das ganze notwendige Equipment gehen trotzdem eher gen 10.000$, auch wenn der Taschensequenzierer für 'nen Tausender zu haben ist.
Weiterer positiver Faktor ist die Zeitersparnis. Im Video ist die Rede davon, dass in einem Rutsch 960 Pilzproben sequenziert werden (mehr wäre auch möglich). Nachteil ist natürlich, dass ich wenn ich bei der Sanger-Sequenzierung Mist baue nur eine unbrauchbare Sequenz habe. Beim nanocoding wären's dann potentiell 960+ unbrauchbare...

Eine manuelle Aufbereitung der Daten (Alignment/Editing) ist mit der Methode gar nicht mehr nötig.

Kontaminationen sind weniger problematisch für das Ergebnis. Wenn euer Pilz von Hypomyces befallen ist, kriegt ihr mit Sanger-Sequencing meist kein verwertbares Ergebnis. Mit Nanopore-Sequencing bekommt ihr einen Barcode sowohl vom untersuchten Pilz als auch vom Parasiten.

Der Vortragende sagt, dass zukünftig weniger die Kosten der einschränkende Faktor sein werden sondern eher genügend Material heranzuschaffen. Dokumentiert und herbarisiert also eure Funde!

Insgesamt bin ich weiterhin der Meinung, dass das für Pilzvereine, die das nötige Kleingeld haben eine Super-Anschaffung wäre. Alternativ könnte man natürlich auch mit Unis kooperieren, die die Geräte vielleicht bereits vor Ort haben. Sich dort 1-2x im Jahr einmieten und dann die interessanten Funde der Mitglieder aus dem Jahr in einem Rutsch durchsequenzieren. Tricholomopsis

Insgesamt merkt man in dem Video, dass die Mykologen in den USA die Bedeutung von Citizen Science erkannt haben und dass sie versuchen auch den "Hobby-Pilzler" als Ressource für die Forschung zu akquirieren. Da können wir uns noch eine Scheibe von abschneiden.

LG.

Zitat von Schupfnudel

Größter Vorteil sind die sehr geringen Kosten um einen Barcode zu erhalten, wenn man entsprechend skaliert und die Flow Cells auslastet (0,60$ pro Barcode vs. 10$+ pro Barcode mit Sanger Sequencing). Die Anschaffungskosten für das ganze notwendige Equipment gehen trotzdem eher gen 10.000$, auch wenn der Taschensequenzierer für 'nen Tausender zu haben ist.

Das ist nicht ganz richtig. So teuer wird es auch nicht.

Hier mal ein Video dazu, wie es Sigrid, die auch hier im Forum schreibt, macht. Die PCR macht sie zu Hause und schickt dann die amplifizierte DNA zur Sequenzierung an ein Labor.

Ist aber trotzdem fraglich, inwieweit sich so ein Setup dann für die Privatperson lohnt. Wenn ein Pilzverein damit arbeitet und sich dann auch die Kosten teilt, kann sowas unter Umständen nach einigen Sequenzierungen dann kostendeckend/lohnenswert sein.

Natürlich ist dann U.U eine lange Einarbeitungszeit bzw. ein erfahrenes Personal notwendig.

Im Studium habe ich oft PCRs und Gele laufen gelassen, da kann einiges schief gehen.

LG

Zu dem Thema DNA-Barcoding , Pilze etc. ist auch dieser Video-Podcast mit Sigrid, wie ich finde, sehr, sehr interessant:

DNA Barcoding, Dung Fungi, Mushroom ID'ing

Hi.

Zitat von Aretah

Hier mal ein Video dazu, wie es Sigrid, die auch hier im Forum schreibt, macht. Die PCR macht sie zu Hause und schickt dann die amplifizierte DNA zur Sequenzierung an ein Labor.

Ja, das Video kenne ich.

Klar wird's von den Anschaffungskosten her billiger, wenn man ein Labor beauftragt, aber es geht doch gerade darum, den kompletten Sequenzierungs-Prozess in Eigenregie zu machen um Kosten zu sparen. Sigrid beschreibt ja nur die DNA-Amplifikation, da fehlt ja immer noch die Sequenzierung. Und da gehört dann eben auch ein potenter Rechenknecht dazu, der die Setup-Kosten ordentlich nach oben treibt. Den könnte man aber vielleicht ebenfalls einfach ein paar Tage leihen um die Kosten zu drücken, wenn man eben alle spannenden Jahresfunde in einem Rutsch sequenziert.

Die Anschaffungskosten amortisieren sich aber relativ zeitnah, wenn man statt rund 20€ pro Sequenz nur noch unter 1€ pro Sequenz zahlt. Macht schon einen Unterschied ob ich 20€ für die Klärung eines Fundes aufwende oder 20€ für die Klärung von 20 Funden.

Man könnte das durchaus auch als Benefit für Vereinsmitglieder anbieten, dass man am Jahresende Vereinsmitgliedern anbietet, dass sie eine gewisse Anzahl an Pilzen einschicken können, die dann sequenziert werden.

Könnte man sogar zur Refinanzierung der Anschaffungskosten plus beispielsweise Aufwandsentschädigung/Schulung des Laboranten nutzen, wenn man da um eine Spende bittet (sagen wir 2-3€ pro Pilz - immer noch eine Riesenersparnis und es bliebe sogar was über für den Verein).

LG.

Oliver: läuft GBOL noch? Meines Wissens lief es 2011-2019, und an Pilzen wurden vor allem Phytos bearbeitet.

Hallo Schupfnudel ,

ich hab mir den Vortrag von Stephen Russel jetzt mal angehört.

Der Anwendungsfall ist etwas anders und überraschend - jedenfalls nicht was der Freizeit-Feldmykologe direkt erwarten würde.

Um sich rasch einen Überblick über die Biodiversität eines Gebietes zu verschaffen kann man ein paar Hundert Pilze in einem "Eintopf" gemeinsam amplifizieren und sequenzieren. Das macht eine Flow-Cell-Platte, die ein paar Hundert Dollar kostet (Einweg), so kommt man auf die rechnerischen 0,60$ pro Sequenz an Materialkosten.

Danach kann man das einzelne Exsikkat aber nicht mehr der einzelnen Sequenz zuordnen, oder? D.h. der Finder wird keinen Namen zu seinem Fund bekommen. Es ist nur eine der paar Hundert Sequenzen, die der Rechner in seiner Analyse ausgespuckt hat. Da oft die Referenzdaten fehlen, war es dann also eine Melanoleuca xy, die vielleicht irgendwann einen Namen bekommen wird. Das, was der Finder auch vorher geahnt hat...

Bei den Kosten sind bisher nur Materialkosten berücksichtigt. Viel höher sind die Personalkosten, wenn nicht (a) ein Studierender das kostenlos für seinen Prof. macht oder (b) sich in einem Verein ein*e Freiwillig*e meldet.

Die erforderlichen Kenntnisse: Chemielaborant und Linux-Anwender.

Für die DGfM würden wir ja gerne einen Sequenzierservice anbieten, und ein paar Tausend Anschaffungskosten und 0,60$/Probe wären kein Hindernis. Beides scheint aber NGS so nicht zu leisten.

Stattdessen könnte man ganz neu über Flächenkartierung nachdenken.

Grüße,

Wolfgang

Hi Wolfgang,

Zitat von Wolfgang P.

Stattdessen könnte man ganz neu über Flächenkartierung nachdenken.

Das ist auf jeden Fall auch ein sinnvoller Anwendungsfall, dachte ich mir auch.

Zitat von Wolfgang P.

Danach kann man das einzelne Exsikkat aber nicht mehr der einzelnen Sequenz zuordnen, oder?

Doch kann man, sonst wäre das tatsächlich nicht sehr hilfreich. Da wird im Video nicht weiter drauf eingegangen, aber du findest den Abschnitt in den Protokollen.

Kurz gesagt, muss man pro Probe den Primer individuell "taggen" um hinterher die Sequenz wieder dem Fund zuordnen zu können.

Wenn die Sequenzen dann einmal da sind und noch keine Referenz für eine Art vorhanden ist oder mehrere Namen rumschwirren wird's dann ja wieder spannend.

Man könnte dann die Exsikkate entsprechenden Spezialisten zukommen lassen, die gucken ob sich auch makroskopische/mikroskopische Abgrenzungen finden lassen, wenn die DNA nahelegt, dass es sich um eine andere Art handelt. Arbeitsteilung ist denke ich insgesamt keine schlechte Idee, also dass man zum Beispiel Leute hat, die vor Ort sammeln/dokumentieren, andere die mikroskopieren und wieder andere mit dem Know-How der Sequenzierung. Das schöne an der Methode ist ja wie ich finde, dass eben Spezialisten und Amateure zusammenarbeiten könnten. Nicht jeder muss alles können.

Die Personalschulung ist durchaus ein Punkt, aber da muss man schauen ob man entsprechende fähige Leute vielleicht schon im näheren Netzwerk hat, die Lust und Zeit haben sich da einzubringen. Bei Chemie denke ich da zum Beispiel direkt an Stefan ( Climbingfreak ), aber dass man entsprechende Protokolle auch als fachfremder Amateur erlernen kann zeigen ja die Videos von Sigrid. Wir im Forum haben ja auch viele Pilz-Spezialisten, die sich viele ihrer Kenntnisse autodidaktisch angeeignet haben.

Selbiges gilt für die Linux-Kenntnisse. Ich habe keine Ahnung von Linux, mir aber vor einiger Zeit einen Server aufgesetzt, der auch heute noch tut was er soll. Ich muss nicht wissen wie Linux aufgebaut ist, sondern nur die Teile lernen, die für mich relevant sind. Ich könnte mir vorstellen, dass auch für das Aufsetzen des Rechners und die "analytical pipeline" zur Analyse der Sequenzen möglich ist. Erfahrungsgemäß teilen die amerikanischen Mykologen auch sehr gerne ihr Wissen, so dass man da bei Fragen/Problemen auch einfach mal direkt anklopfen kann und sich vielleicht mal in einem Zoom-Meeting austauscht.

LG,

Schupfi

Zitat von Schupfnudel

Wenn die Sequenzen dann einmal da sind und noch keine Referenz für eine Art vorhanden ist oder mehrere Namen rumschwirren wird's dann ja wieder spannend.

Man könnte dann die Exsikkate entsprechenden Spezialisten zukommen lassen,

Hallo Schupfi,

das ist ja auch eines der Nachholbedarfe in DE. In vielen Gattungen siehts dünn aus mit Spezialisten, und die sind auch meist nicht an den Unis.

Sequenzen ohne Referenz gibt es auch schon zuhauf, auch noch ohne Flächenscreening. Aber zuerst müssten die Typen sequenziert oder neotypisiert werden, sonst wird man nie entscheiden können, was neu ist und was nicht.

Und dann wollen Spezialisten immer häufiger Frischmaterial untersuchen, weil am Exsikkat eben doch viele Merkmale verloren gehen (nicht nur bei Ascos).

So ganz einfach wird es also nicht. Dem normalen Pilzverein um die Ecke würde ich jedenfalls nicht zur Anschaffung des Equipments raten, selbst wenn die Vereinskasse gut gefüllt ist.

Für die DGfM nehme ich gerne konstruktive Vorschläge entgegen, wie man das organisieren könnte.

Grüße,

Wolfgang

Hallo,

ich finde es gut sich mit dem Thema zu befassen und Neuerungen auf dem Gebiet aufgeschlossen zu prüfen. Hardware und Personal mit dem erforderlichen Wissen und den notwendigen Fertigkeiten sind sehr wichtig. Aber auch die kontinuierliche Organisation und geeigneten Räumlichkeiten sind zu prüfen. Das sind schon vier Erfordernisse für solch ein Projekt. Für einen Verein schon eine sehr anspruchsvolle Aufgabe. Dank an alle, die hier so tolle, interessante Infos geliefert haben!

Beste Grüße

Stefan F.